Der computeranimierte Abenteuerfilm "Der Super Mario Bros. Film" handelt von den Brüdern Mario und Luigi, die gerade ihr Klempnergeschäft in Brooklyn eröffnet haben. Ihr Vater ist nicht einverstanden mit Marios Entscheidung, seinen vorherigen Job aufzugeben. Als in den Nachrichten über eine Überschwemmung in Brooklyn berichtet wird, begeben sich Mario und Luigi in die Kanalisation, um die Rohre zu reparieren. Dabei werden sie jedoch durch ein mysteriöses Rohr gesaugt und voneinander getrennt. Mario findet sich im Pilzkönigreich wieder, das von Prinzessin Peach regiert wird, und trifft dort auf Toad, der ihm mitteilt, dass Luigi im gefährlichen „Dunkelland“ gelandet ist. Im Dunkelland herrscht der böse König Bowser, der Prinzessin Peach heiraten und das Pilzkönigreich zerstören will, sollte sie seinen Antrag ablehnen. Toad bringt Mario zu Peach, während Luigi von Bowsers Schergen gefangen genommen wird. Um sich gegen Bowser zu verteidigen, plant Peach ein Bündnis mit dem Dschungelkönigreich und nimmt Mario und Toad mit sich. Im Verlauf der Geschichte müssen sich Mario und seine Verbündeten verschiedenen Herausforderungen stellen, darunter die Konfrontation mit Donkey Kong, Verfolgungen und schließlich dem mächtigen Bowser selbst, um Luigi zu befreien und das Pilzkönigreich zu retten. Die Ereignisse führen sogar dazu, dass Elemente des Pilzkönigreichs nach Brooklyn gelangen. Letztendlich müssen die Brüder all ihre Fähigkeiten einsetzen, um Bowser und seine Armee aufzuhalten.