Das Sequel macht da weiter, wo der erste Teil aufhörte. Im "Super Mario Bros. Film" konnten sich Mario und Luigi als Helden bewähren und Schildkröten-Schurke Bowser besiegen. Ihren Alltag in Brooklyn haben die beiden inzwischen hinter sich gelassen. Stattdessen haben sie nun in den phantastischen Gefilden des Pilz-Königreichs eine neue Heimat gefunden. Dort helfen sie, wo sie nur können und haben jede Menge Spaß. Nur Prinzessin Peach hadert gelegentlich mit ihrer ungeklärten Herkunft.
Derweil mutiert der zum Mini-Schurken geschrumpfte Bowser zum Möchtegern-Künstler und träumt noch immer von Prinzessin Peach. Sehr zum Unmut von Mario, der sich offenbar selbst zur Prinzessin hingezogen fühlt. Schon bald hat der Klempner jedoch ein ganz anderes Problem: Bowser Jr. will seinem Vater zu alter Größe verhelfen – und dafür ist dem kleinen Racker scheinbar jedes Mittel Recht.