Der Teenager Miles Morales hat Schwierigkeiten, sich in seinem neuen Internat einzuleben und den Erwartungen seines Vaters, einem Polizisten, gerecht zu werden. Eines Abends wird er beim Sprayen von Graffiti in einem verlassenen U-Bahn-Schacht von einer Roboter-Spinne gebissen und entwickelt daraufhin spinnenähnliche Fähigkeiten. Als Miles später zu dem Ort zurückkehrt, findet er den Collider, einen Teilchenbeschleuniger, der von Wilson Fisk, alias Kingpin, gebaut wurde, um in parallele Universen einzudringen.

Miles wird Zeuge eines Kampfes zwischen dem ursprünglichen Spider-Man und Kingpins Leuten, dem Green Goblin und dem Prowler. Spider-Man bemerkt Miles und erkennt, dass auch er Spinnenkräfte besitzt. Im Kampf wird Spider-Man jedoch in den Collider gestoßen und schwer verletzt. Bevor er stirbt, gibt er Miles einen USB-Stick, mit dem der Collider deaktiviert werden kann, und warnt ihn, dass die Maschine die Stadt zerstören könnte, wenn sie reaktiviert wird. Miles muss entsetzt mitansehen, wie Kingpin Spider-Man tötet.

Nach Spider-Mans Tod probiert Miles seine neuen Fähigkeiten aus, beschädigt aber den USB-Stick. Am Grab von Spider-Man trifft Miles auf Peter B. Parker, eine ältere, abgekämpfte Version von Spider-Man aus einem anderen Universum, die ebenfalls durch den aktivierten Collider in Miles' Realität gelangt ist. Es stellt sich heraus, dass der Betrieb des Colliders dazu führt, dass sich verschiedene Spider-People aus anderen Dimensionen in Miles' Welt manifestieren, darunter Gwen Stacy, Spider-Woman; Spider-Man Noir; Spider-Ham; und Peni Parker. Sie alle leiden unter den Auswirkungen des Dimensionswechsels. Miles entdeckt weitere seiner Kräfte, wie die Fähigkeit, elektrische Schocks auszusenden und unsichtbar zu werden. Die Spider-People erkennen, dass der Collider eine Gefahr für alle Dimensionen darstellt und muss gestoppt werden.